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M-MLV反转录酶图片
产品货号:
RFT237
中文名称:
M-MLV反转录酶
英文名称:
Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)
产品规格:
2000U
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
M-MLV反转录酶(RNase H-),是一种经过改造和优化的反转录酶。和普通的M-MLV反转录酶相比,缺失了Ribonuclease H (RNase H)酶活性,不能够选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA,可以合成长片段从DNA。

M-MLV反转录酶(RNase H-)可以合成长达9~13kb的cDNA。该反转录酶的最适反应温度为42~45℃并且在55℃时仍然有很高活性,可以避免普通的M-MLV反转录酶(RNase H-)在37℃反应时的一些不足。


M-MLV反转录酶(RNase H-)常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。


组分规格
M-MLV反转录酶(RNase H-,200U/μl)10μL
5×RT buffer200μL

保存:-20℃


本产品中M-MLV反转录酶(RNase H-)的浓度为200U/μl,用于体积为20微升的反转录体系时足够进行10次反转录反应。


50mM Tris,pH8.3,100mM NaCl,1mM EDTA,5mM DTT,0.1% Triton X-100,50% glycerol。


该反转录酶(RNase H-)由大肠杆菌表达。


一个单位是指37℃条件下10分钟内将1nmol dTMP掺入多聚核苷酸所需的酶量。

活性检测条件:
50mM Tris-HCl (pH8.3),6mM MgCl2,10mM DTT,40mM KCl,0.5mM dTTP,0.4MBq/ml [3H]-dTTP,0.4mM polyA·oligo(dT)12-18


不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶,可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。


70℃孵育10分钟可以导致M-MLV反转录酶(RNase H-)失活;EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对该反转录酶(RNase H-)有抑制作用。


一、cDNA第一链合成
  • 0.2mL PCR管中配制模板/引物变性混合液:
    加样顺序成分用量
    1模板RNA1ng~1μg*
    2Oligo(dT)18primer(100μM)
    或Random primer(100μM)
    或Specific primer(10μM)
    0.5μL
    3RNase-free水Up to 6μL

    *:Total RNA的使用量一般为1ng~1μg;mRNA的使用量一般为10pg~1μg。
  • 70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。
    注:此步骤是打开RNA的一些比较稳定的二级结构。
  • 离心数秒钟使模板RNA/引物的变性混合液聚集于离心管底部。
  • 在上述离心管中配制下列反转录反应液。
    加样顺序成分用量
    1模板/引物变性混合液6μL
    25×RT buffer2μL
    310mM dNTP0.5μL
    4(可选)RNase Inhibitor(40U/μl)0.25μL
    5M-MLV(RNase H-)0.25~1μL*
    6RNase-free水up to 10μL

    *:当起始模板RNA量>500ng时,M-MLV(RNase H-)的使用量应>0.25μL。
  • 若使用Oligo(dT)18或基因特异性引物,42℃温育30min;若使用随机引物,先30℃温育5min,之后42℃温育30min;
  • 70℃保温10分钟后冰上冷却,得到的cDNA溶液可直接用于PCR扩增,PCR扩增时cDNA溶液的推荐使用量50μL体系加2μL。
    注:cDNA溶液置于-20℃可保存半年;置于-80℃可长期储存。

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